1 流式細(xì)胞儀的概念及其發(fā)展歷史
1．1 流式細(xì)胞儀的基本概念流式細(xì)胞儀（flow cytonletry，FCM）是對(duì)高速直線流動(dòng)的細(xì)胞或生物微粒進(jìn)行快速定量測(cè)定和分析的儀器，主要包括樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分選技術(shù)，計(jì)算機(jī)對(duì)數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。流式細(xì)胞儀以流式細(xì)胞術(shù)為理論基礎(chǔ)，是流體力學(xué)、激光技術(shù)、電子工程學(xué)、分子免疫學(xué)、細(xì)胞熒光化學(xué)和計(jì)算機(jī)等學(xué)科知識(shí)綜合運(yùn)用的結(jié)晶。流式細(xì)胞術(shù)是一種自動(dòng)分析和分選細(xì)胞或亞細(xì)胞的技術(shù)。其特點(diǎn)是：測(cè)量速度快、被測(cè)群體大、可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，即對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、生物化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有效。
1．2 流式細(xì)胞儀的發(fā)展簡史早的流式細(xì)胞儀雛形誕生于1934年，Moldavan提出使懸浮的單個(gè)血紅細(xì)胞流過玻璃毛細(xì)管，在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用光電記錄裝置測(cè)量的設(shè)想。1953年Crosland —Taylor根據(jù)牛頓流體在圓形管中流動(dòng)規(guī)律設(shè)計(jì)了流動(dòng)室。其后又經(jīng)過Coulter Parker Horst Kamentsky1 Gohde、Fulwyler Herzen—berg等人的不斷改進(jìn)，設(shè)計(jì)了光電檢測(cè)設(shè)備和細(xì)胞分選裝置、完成了計(jì)算機(jī)與流式細(xì)胞儀的物理連接及多參數(shù)數(shù)據(jù)的記錄和分析、開創(chuàng)了細(xì)胞的免疫熒光染色及檢測(cè)技術(shù)、推廣流式細(xì)胞儀在臨床上的應(yīng)用?。近20年來，隨著流式細(xì)胞儀及其檢測(cè)技術(shù)和的13臻完善，人們?cè)絹碓接跇悠分苽?、?xì)胞標(biāo)記、軟件開發(fā)等方面的工作，以擴(kuò)大FCM的應(yīng)用領(lǐng)域和使用效果。*根的《流式細(xì)胞術(shù)的原理和應(yīng)用》是迄今為止對(duì)流式細(xì)胞儀及其技術(shù)闡述的為詳盡和透徹的中文著作。這本書非常詳細(xì)地介紹了流式細(xì)胞術(shù)的歷史、結(jié)構(gòu)、原理、技術(shù)指標(biāo)等，例舉了其在醫(yī)學(xué)和生物工程中的應(yīng)用，非常適合從事此方面專業(yè)研究的人。由于這本書是13年前出版的，所以基本上沒有涉及植物流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)。此外對(duì)于只需要對(duì)流式細(xì)胞儀有些基本認(rèn)識(shí)的人士來說，這本書太復(fù)雜太深?yuàn)W。謝小梅 主要介紹了流式細(xì)胞儀在生物工程中的應(yīng)用。楊蕊 概括了流式細(xì)胞儀的工作原理，簡單提及了流式細(xì)胞儀的應(yīng)用。本文在分析這三篇論著或文章的優(yōu)缺點(diǎn)后，用比較通俗的語言介紹了掌握流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)必須了解的一些原理，并對(duì)目前市場(chǎng)上的主流型號(hào)進(jìn)行了客觀的性能概括。
2 流式細(xì)胞儀的工作原理和技術(shù)指標(biāo)
2．1 流式細(xì)胞儀工作原理 除電源外，流式細(xì)胞儀主要由四部分組成：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)：激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測(cè)系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)，其中流動(dòng)室是儀器的核心部件。這四大部件共同完成了信號(hào)的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸?shù)娜蝿?wù)。
2．1．1 信號(hào)的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸在壓力作用下，鞘液管中的鞘液被持續(xù)不斷地壓入流動(dòng)室，形成一股穩(wěn)定地連續(xù)的液流，了樣本液穩(wěn)定地處于鞘液液流的軸線上，并以單個(gè)細(xì)胞形式直線通過激光照射區(qū)。激光照射區(qū)又稱測(cè)量區(qū)，是指液流與激光束垂直相交的點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物通過激光照射區(qū)時(shí)，產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)部不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號(hào)，這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360。立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)，因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)或固有參數(shù)。散射光又包括前向角散射和測(cè)向角散射。前向角散射與被測(cè)細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)，測(cè)向角散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。熒光信號(hào)也有二種；一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出的微弱熒光信號(hào)，另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記后的細(xì)胞受激發(fā)照射后得到的熒光信號(hào)。在免疫分析中常要同時(shí)探測(cè)兩種以上波長的熒光信號(hào)，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。
經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受到適合的光激發(fā)后產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)而進(jìn)行測(cè)量的。常用的光電轉(zhuǎn)換器是光電倍增管（PMT）。從PMT輸出的電信號(hào)需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。流式細(xì)胞儀中一般備有兩類放大器。一類是線性放大器，其輸出信號(hào)與輸入信號(hào)成線性關(guān)系。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物學(xué)線性過程的信號(hào)，如DNA測(cè)量等。另一類是對(duì)數(shù)放大器，其輸出信號(hào)和輸入信號(hào)之間成常用對(duì)數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測(cè)量中常使用對(duì)數(shù)放大器。
放大后的電信號(hào)被傳送到計(jì)算機(jī)，再經(jīng)模一數(shù)轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)轿C(jī)處理器形成數(shù)據(jù)文件，保存在計(jì)算機(jī)上。保存在計(jì)算機(jī)上的數(shù)據(jù)可在脫機(jī)后再進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。
2．1．2 流式細(xì)胞儀分選原理并不是所有的流式細(xì)胞儀都具有分選功能。流式細(xì)胞儀的分選功能是由細(xì)胞分選器來完成的。由噴嘴射出的液流柱在電信號(hào)作用下發(fā)生振動(dòng)，斷裂形成均勻的小液滴。根據(jù)選定的某個(gè)參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對(duì)選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過靜電場(chǎng)而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中。使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會(huì)改變分選效果。從參數(shù)測(cè)定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時(shí)間。測(cè)定延遲時(shí)間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，可根據(jù)具體要求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。 2．1．3 數(shù)據(jù)的顯示和分析數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析。單參數(shù)直方圖是使用多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。單參數(shù)直方圖是由x、Y二方向組成的二維平面圖。橫座標(biāo)x是所測(cè)的熒光或散射光的強(qiáng)度，用“道數(shù)”（Channel No．）來表示。選擇的放大器類型不同，標(biāo)度不同。縱座標(biāo)Y通常表示被測(cè)細(xì)胞的數(shù)目。正常情況下，數(shù)據(jù)分析得到的圖形為具有一個(gè)或若干個(gè)峰的曲線圖。對(duì)曲線圖的解釋應(yīng)該具體問題具體分析。
除直方圖外，數(shù)據(jù)顯示方式還包括二維點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。二維點(diǎn)圖也是比較常用的數(shù)據(jù)顯示類型。它顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系，也是二維平面圖，橫縱坐標(biāo)可以根據(jù)自己選定的被測(cè)參數(shù)自行決定，點(diǎn)的位置表明了細(xì)胞和顆粒具有的二個(gè)被測(cè)參數(shù)的數(shù)值。二維點(diǎn)圖所提供的信息量要大于單參數(shù)直方圖。
數(shù)據(jù)分析的方法大體可分為參數(shù)法和非參數(shù)法兩大類。當(dāng)被檢測(cè)的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型時(shí)則多使用參數(shù)方法。非參數(shù)分析法不用對(duì)顯示的圖像做任何假設(shè)，也不采用數(shù)學(xué)模型，分析程序可以很簡單．也可能很復(fù)雜。臨床醫(yī)學(xué)較常使用非參數(shù)分析法。
2．2 流式細(xì)胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)流式細(xì)胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光分辨率是指分辨兩個(gè)相鄰峰的小距離，通常用變異系數(shù)（CV值）來表示?，F(xiàn)在市場(chǎng)上主流型號(hào)出廠時(shí)的熒光分辨率應(yīng)該小于2.0％。熒光靈敏度反映了儀器探測(cè)小熒光光強(qiáng)的能力。一般用熒光微球上可測(cè)出的FITC的少分子數(shù)來表示。目前儀器均可達(dá)到1000左右。儀器工作時(shí)樣品濃度一般在105—107細(xì)胞／m1。分析速度／分選速度是指流式細(xì)胞儀每秒種可分析或分選的顆粒數(shù)目。一般分析速度為5000—10000，分選速度控制在1000以下。
流式細(xì)胞儀測(cè)量的數(shù)據(jù)是相對(duì)值，因此需要在使用前對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定。流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)有二個(gè)目的，即儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。通常使用標(biāo)準(zhǔn)微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。
3 主流流式細(xì)胞儀型號(hào)及其特性介紹
目前擁有市場(chǎng)較大份額的公司是美國的BD（Becton— Dickinson）公司、Beckman—Coulter公司（原名稱Cou1．ter）和德國的Partec公司。
3．1 BD公司流式細(xì)胞儀介紹BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀都冠以FACs（fluorescence activated cell sorter），即熒光激活細(xì)胞分選器。其型號(hào)種類比較齊全，如早期的FAC．Sort、FACS Canto、FACSean，。現(xiàn)在市場(chǎng)上供應(yīng)的型號(hào)有五種：FACSCount（小型流式細(xì)胞儀）、FACSCAlibur（流式細(xì)胞儀）、FACSAfia（流式細(xì)胞分選儀）、FACSVantage SE（多色分析和高速分選流式細(xì)胞儀）、LSRII（數(shù)字化分析型流式細(xì)胞儀）。
FACSCount為計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞CD3，CD4，CD8數(shù)而設(shè)計(jì)的。FACSCalibur是全自動(dòng)多色流式系統(tǒng)，偏重于臨床，其整體設(shè)計(jì)幫助臨床醫(yī)生快速實(shí)現(xiàn)常規(guī)免疫表型、CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)、DNA、網(wǎng)織紅細(xì)胞、血小板等臨床分析，兼具分選功能。配備有二根激光管，可同時(shí)檢測(cè)4個(gè)熒光參數(shù)。可識(shí)別粘聯(lián)細(xì)胞。
BD FACSAfia流式細(xì)胞分選儀為臺(tái)式高速細(xì)胞分選儀，獲取速度達(dá)70，000細(xì)胞/s，分析速度達(dá)50，000細(xì)s。使用石英杯流動(dòng)檢測(cè)池固定光路校準(zhǔn)技術(shù)。使用三種激光，多色分析，分析參數(shù)可達(dá)15色。兩管或四管分選，可以使用多種規(guī)格的收集管。液流監(jiān)測(cè)系統(tǒng)白動(dòng)監(jiān)測(cè)液流斷點(diǎn)，檢查堵塞，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞分選的無人操作。配件BDACDU裝置，可以在微孔板或載波片上定量分選細(xì)胞。FACSVantage SETM是在FACSVantage的細(xì)胞分選功能基礎(chǔ)上推出的分選增強(qiáng)型流式細(xì)胞儀。六色熒光分析系統(tǒng)，點(diǎn)對(duì)點(diǎn)分選，配置FACS Diva數(shù)字化系統(tǒng)，提供的配套試劑。速度和功能優(yōu)于FACSVantage。
BD LSR II是LSR的數(shù)字化升級(jí)版，其性能介于FACSVantage SE和FACS Calibur之間，是專為生命科學(xué)研
究設(shè)計(jì)的臺(tái)式機(jī)。配備固定校準(zhǔn)的紫外激光，四種激光立體空間激發(fā)、十色熒光同時(shí)分析、電子系統(tǒng)數(shù)字化、比較易學(xué)易用。
3．2 Beckman—Coulter公司流式細(xì)胞儀介紹 Beckman— Coulter公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀以Profile（早期，現(xiàn)已停產(chǎn)）和EPICS系列為代表，近年又推出了Cytomics FC500系列。EPICS系列是大型流式細(xì)胞儀，目前市場(chǎng)上有XL、XL—MCL和ALTRA三種型號(hào)，其中ALTRA具有分選功能，適用于免疫學(xué)、細(xì)胞生理、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、水質(zhì)分析和植物細(xì)胞分析。Cytomics FC500系列流式細(xì)胞儀體積小，可自動(dòng)進(jìn)行5種顏色的分析，適用于免疫學(xué)檢測(cè)，如人類HIV診斷。特別是FC50OMPL的*設(shè)計(jì)可以在同一系統(tǒng)上使用12×
3．3 Partee公司流式細(xì)胞儀介紹 與BD和Becman—Coutler公司的產(chǎn)品相比，德國Partee公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀的共同特點(diǎn)是體積小，造價(jià)低，易操作，便于攜帶，適合植物學(xué)研究，適合邊遠(yuǎn)地區(qū)和發(fā)展中國家。德國Partec公司的產(chǎn)品分為三類：CCA家族、PAS家族和CyFlow家族（Galaxy為早期產(chǎn)品，已停產(chǎn)）。CCA家族包括細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀CCA和倍性分析儀PA—I。它是單或雙參數(shù)的臺(tái)式小型機(jī)，可以進(jìn)行一些常規(guī)分析，如核DNA測(cè)定（檢測(cè)倍性或細(xì)胞周期）、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞凋亡。它的特點(diǎn)是體積小，易操作，價(jià)格低，檢測(cè)范圍廣，可以檢測(cè)多種熒光素（如PI、DAPI、Fluorescein）發(fā)出的熒光。PAS家族包括粒子分析系統(tǒng)PAS、粒子分析系統(tǒng)III（PAS—III）和倍性分析儀PA—II。提供三種激光器的三種組合，可檢測(cè)十余種熒光染料。多可檢測(cè)和記錄八個(gè)獨(dú)立熒光參數(shù)。
倍性分析儀PA能夠在2分鐘內(nèi)自動(dòng)測(cè)量植物的倍性水平，檢測(cè)異倍體。可以對(duì)葉片、幼苗、種子、果皮、根、花等植物材料進(jìn)行分析。在大多數(shù)植物中，異倍體染色體的檢測(cè)分辨率為±1條染色體。PA—I使用HBO一100汞燈，屬于弧光燈，可產(chǎn)生紫外激發(fā)光和藍(lán)光。PA—II中增加了488 am氬離子激光器，能夠檢測(cè)幾乎所有的熒光染料，如DAPI，Hoeehst，PI，EB，MMC，FITC，FDA等。汞燈發(fā)光是電流經(jīng)過氣體時(shí)，氣體電離產(chǎn)生的。它能提供佳的激發(fā)波長。
CyFlow（R）SL配備三種激光管，可應(yīng)用于諸如人類健康、微生物學(xué)、工業(yè)應(yīng)用、過程控制、生態(tài)學(xué)等研究。如HIV掃描中免疫標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)、食品處理過程中的微生物計(jì)數(shù)、細(xì)胞凋亡等。它使用l2 V直流電，特別適合邊遠(yuǎn)地區(qū)和發(fā)展中國家。
上20世紀(jì)80年代開始將流式細(xì)胞儀檢測(cè)應(yīng)用到植物的研究中（Galbraith ，1983），眾多學(xué)者都認(rèn)為流式細(xì)胞儀是一種、快速的檢測(cè)DNA含量的方法（Michae|son ，1991）。應(yīng)用范圍主要是利用流式細(xì)胞儀研究屬內(nèi)、屬間多種植物的DNA含量（Baird ]，1994；Ja—cob[，1996；HALL ，2000）和倍性水平（Costich ，1993；Meng[101，2002）、檢測(cè)體細(xì)胞雜種（Pfosser? ，1995；Kel—ler[”，1996）和游離小孢子培養(yǎng)再生株（Kim¨3 ，2003）的DNA含量。過去我國應(yīng)用這一檢測(cè)技術(shù)的植物研究工作者，且大多是在國外實(shí)驗(yàn)室完成的。研究內(nèi)容包括植物生理Ⅲ 引、程序性死亡Ⅲ 、倍性鑒定mI2 等。植物研究中使用的流式細(xì)胞儀基本上都是Partec公司的產(chǎn)品，也有少量是BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀。BD公司的產(chǎn)品主要定位于醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用，與Partec產(chǎn)品相比，不太適合從事植物染色體倍性的鑒定。主要體現(xiàn)在不能提供植物樣品制備技術(shù)／試劑，數(shù)據(jù)獲取軟件可同時(shí)檢測(cè)到的倍性數(shù)目少。
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