實時熒光定量PCR（Real-TimePCR，簡稱qPCR）是一種基于聚合酶鏈式反應（PCR）的高靈敏度、高特異性的分子生物學技術，用于定量分析DNA或RNA的含量。它通過實時監(jiān)測PCR反應過程中產生的熒光信號的變化來實現(xiàn)對靶標核酸的定量分析。
原理定義：
實時熒光定量PCR系統(tǒng)的原理基于PCR反應的擴增過程，在此過程中利用熒光染料或熒光探針對PCR產物進行實時檢測和定量。
PCR擴增過程：
通過PCR擴增反應，DNA模板經(jīng)過多個循環(huán)逐步擴增，生成大量的目標DNA片段。
在每一個循環(huán)中，模板DNA會被熱變性（使雙鏈DNA分開）、退火（引物與模板配對）和延伸（DNA聚合酶合成新鏈）等步驟逐漸擴增。
熒光信號的產生：
在擴增過程中，熒光染料或探針與PCR產物結合，產生熒光信號。實時PCR系統(tǒng)通過監(jiān)測這些熒光信號的變化來判斷目標核酸的數(shù)量。
常用的熒光探針和染料包括：
SYBRGreen：與雙鏈DNA結合時發(fā)出熒光，適用于檢測PCR產物。
TaqMan探針：是一種帶有熒光基團和猝滅基團的探針，只有當探針與目標DNA結合并在PCR反應過程中被DNA聚合酶切割時，才會釋放熒光信號。
MeltCurve分析：通過熔解曲線分析，可以進一步確認PCR產物的特異性。
實時檢測和定量：
在每一輪PCR擴增的過程中，實時熒光定量PCR系統(tǒng)都會在每一個擴增周期結束時，檢測熒光信號的強度。
熒光信號的強度與PCR產物的數(shù)量成正比，因此可以通過熒光信號的變化曲線來推算目標核酸的初始濃度。
在PCR反應的指數(shù)擴增階段，熒光信號與目標DNA的量呈指數(shù)關系，系統(tǒng)可以通過分析信號的上升曲線（Ct值，臨界閾值）來定量目標DNA或RNA的濃度。
定量分析：
Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）：是指PCR反應中，熒光信號達到預設的閾值時的循環(huán)數(shù)。Ct值與樣本中的初始靶標DNA/RNA濃度成反比，Ct值越小，表示初始模板的濃度越高。
標準曲線法：使用已知濃度的標準品構建標準曲線，根據(jù)樣本的Ct值對其進行定量。
相對定量：可以通過對照基因或內參基因的表達量與目標基因的表達量進行比對，得出目標基因的相對表達量。
優(yōu)點：
高靈敏度與高特異性：通過實時監(jiān)測熒光信號，可以在PCR擴增的初期階段檢測到目標核酸，具有很高的靈敏度和特異性。
定量精準：實時監(jiān)測每一個PCR循環(huán)中的熒光信號，可以精確地定量目標核酸的初始含量。
無需后期電泳：與傳統(tǒng)的PCR方法不同，實時熒光定量PCR不需要使用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，減少了操作時間和誤差。
應用：
基因表達分析：用于檢測基因的相對或絕對表達量。
病原檢測：如病毒、細菌等的定量檢測。
基因突變分析：檢測特定基因的突變。
定量檢測DNA、RNA：適用于定量DNA或RNA模板，包括mRNA、miRNA、DNA甲基化等。
實時熒光定量PCR為分子生物學研究和臨床應用提供了強大的工具，尤其是在基因表達、疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測等領域。
